TITLE

Optimized production of the Diels-Alderase antibody 1E9 as a chimeric Fab

AUTHOR(S)
Piatesi, Andrea; Hilvert, Donald
PUB. DATE
June 2002
SOURCE
Canadian Journal of Chemistry;Jun2002, Vol. 80 Issue 6, p657
SOURCE TYPE
Academic Journal
DOC. TYPE
Article
ABSTRACT
Monoclonal antibody 1E9, which catalyzes the [4+2] cycloaddition between tetrachlorothiophene dioxide and N-ethylmaleimide, has been re-engineered for production as a chimeric human–murine Fab fragment in Escherichia coli. Stabilizing point mutations in the variable regions of the antibody were identified by replacing residues that rarely occur at individual positions in aligned immunoglobulin sequences with their consensus counterparts. By combining favorable substitutions, double (Met[sup H87] Thr–Gly[sup L63] Ser) and triple (Met[sup H87] Thr–Gly[sup L63] Ser–Phe[sup L95] Pro) mutants were created, which can be produced in good yield (4 and 17 mg L[sup –1] cell culture, respectively). The triple mutant exhibits a modest fourfold drop in the apparent k[sub cat] value for the cycloaddition reaction, but the kinetic properties of the double mutant are indistinguishable from those of the parent murine IgG. The availability of recombinant versions of this catalytic antibody will facilitate efforts to determine the origins of its selectivity and catalytic efficiency through mutagenesis.Key words: catalytic antibody, Fab fragment, bacterial production.L'anticorps catalytique monoclonal 1E9, qui catalyse la cycloaddition [4+2] entre le dioxide de tétrachlorothiophène et le N-éthylmaleimide, a été modifié afin de permettre la production d'un fragment chimérique (humain–murine) Fab dans l'Escherichia coli. L'identification des mutations ponctuelles stabilisantes dans les régions variables de l'anticorps, a été réalisée en remplaçant les résidus rarement présents dans les alignements des séquences d'immuno globulines par les résidus de plus grande occurrence. En combinant les substitutions favorables, on a créé les mutants double (Mer[sup H87] Thr–Gly[sup L63] Ser) et triple (Met[sup H87] Thr–Gly[sup L63] Ser–Phe–[sup L95] Pro) qui ont été produits avec de bons rendements (respectivement de 4 et 17 mg L[sup –1] de culture cellulaire). Alors que le mutant triple présente, pour la réaction de cycloaddition, une diminution d'un facteur 4 de la valeur du k[sub cat] apparent, les propriétés cinétiques du mutant double sont identiques à celles de la murine originelle. L'accessibilité à des versions recombinantes de cet anticorps permettra, par le biais de la mutagenèse, de déterminer les origines de l'activité catalytique de 1E9 ainsi que sa sélectivité.Mots clés : anticorps catalytique, fragment Fab, production bactérienne.[Traduit par la Rédaction]
ACCESSION #
10586788

 

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